Експрес-діагностика сказу

Методи виявлення антигенів . При сказі для експрес-діагностики можна використовувати методи флуоресціюючих антитіл (МФА), реакції преципітації (РП) в агарових гелі, методи імуноферментного аналізу (ІФА), полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Для прижиттєвої діагностики сказу у людини потрібно кілька тестів.

Визначення антитіл до антигенів вірусу сказу . Виявлення антитіл у сироватці крові або в цереброспінальній рідини – важливий метод діагностики. Серологічне дослідження рабіес-специфічних антитіл проводиться в сироватці крові для визначення перед-і постекспозіціонной вакцинації та визначення часу бустерной імунізації з метою підвищення імунної відповіді.

Виділення вірусу . Для виділення та ідентифікації вірусу використовують метод біопроби на білих мишах. Досліджуваний матеріал суспендується у фізіологічному розчині, що містить антибіотики та ембріональну сироватку великої рогатої худоби. Суспензія вводиться интрацеребрально білим мишам масою 5-6 г. Для доказу розвитку інфекції за мишами щодня спостерігають до 30-го дня після інокуляції. Миші, у яких за цей період розвивається захворювання, негайно піддаються евтаназії, і тканини мозку досліджуються методом прямої МФА.

Перевага даного підходу полягає в можливості визначити малі кількості вірусу сказу в матеріалі. Недолік методу – необхідність багатоденного (7-18 діб) очікування між інокуляцією і проявом перших ознак захворювання. Для скорочення інкубаційного періоду застосовують мишей-сисунів. Для експрес-діагностики можна використовувати мишей у віці менше 3 днів: у мишей, забитих через 3 дня, вже виявляється антиген вірусу в мозку, який можна виявити методом МФА.

Такий метод виділення вірусу практикується як підтверджуючий діагностичного тесту при негативних результатах з виявлення антигену і тілець Бабеша – Негрі і в разі укусу людини підозрілою на сказ твариною. Він забезпечує належну чутливість і специфічність, тобто розцінюється на рівні діагностичної значимості методу прямої імунофлуоресценції. Крім того, цей метод є основним для ідентифікації варіантів вірусу і перспективний для розробки діагностичних реагентів.

Виділення та ідентифікація вірусу на культурі клітин . Основним недоліком виділення вірусу при інфікуванні лабораторних тварин є тривалість методу. Уникнути цього можна при використанні культур клітин. Зазвичай для цих цілей використовують культуру клітин нейробластоми мишей, якщо потрібно досліджувати тканини головного мозку. Мозок суспендується в культуральній живильному середовищі, суспензію наносять на моношар культури клітин і інкубують від одного до декількох днів.

Чутливість даної культури до вірусу можна підвищити обробкою її ДЕАЕ декстраном. Моношар клітин потім відмивають, фіксують на холоді ацетоном або сумішшю формаліну з метанолом і досліджують методом імунофлюоресценції. Якщо тварина було інфіковано вірусом сказу, то в монослое культури клітин виявляються цитоплазматичні включення антигену вірусу сказу.

Хоча вірус сказу володіє облигатной нейропатогенностью in vivo, він здатний інфікувати широке коло клітин-господарів in vitro, що можна використовувати для дослідження інших тканин і органів на наявність вірусу сказу. Встановлено, що вірус сказу розмножується в клітинах ВНК-21 і Vero, в первинних клітинах курячих ембріонів або нирок хом’яка. Показано, що адсорбція вірусу і впровадження його в клітку відбуваються протягом 7 годин. Через 24-48 годин всередині клітини утворюються нові вірусні частки, через 72 годин відбувається брунькування їх з клітинної оболонки у міжклітинний простір.

г) метод біопроби – для виділення вірусу на ранніх етапах захворювання або для виявлення антитіл у крові або спинномозкової рідини на пізніх стадіях захворювання. Для експрес-діагностики використовується комплексний метод (биопроба + МФА), що полягає в зараженні досліджуваним матеріалом 2-денних новонароджених мишей і дослідження їхнього мозку на 3-4-у добу в МФА.

Вибір методів прижиттєвої діагностики значною мірою залежить від стадії хвороби: метод, заснований на виявленні антигенів, як правило, має високу чутливість в кінці інкубаційного періоду, протягом перших кількох днів захворювання, в той час як вируснейтрализующие антитіла зазвичай з’являються в спинномозковій рідини і сироватці крові після 7-10 днів від початку хвороби.

Реакція імунофлюоресценції . Метод заснований на використанні антитіл, пов’язаних з барвником, наприклад, флюоресцеінізотіоціанатом. РИФ широко застосовується для виявлення вірусних антигенів в матеріалі хворих і для швидкої діагностики.

Пряма імунофлуоресценція залишається найбільш віддається перевага методом діагностики сказу. Предметні скла, що містять мазки-відбитки тканин мозку, або скла з монослоем культури тканин фіксують в ацетоні протягом 1-4 годин. Потім препарати висушують і обробляють флуоресціюючими поліклональними антінуклеокапсіднимі антитілами (імунофлуоресцентний реагент).

Цей реагент являє собою кон’югат, приготований з специфічних поліклональних антитіл IgG класу до нуклеокапсідний антигену вірусу і флуоресцеїну ізоціанату (ФИТЦ). Специфічні антитіла отримують шляхом гипериммунизации тварин (кроликів, хом’яків або коней) сумішшю епітопів нуклеокапсида вірусу.

В даний час для цих цілей все ширше використовують мишачі моноклональні антитіла до Нуклеокапсид вірусу сказу. Після 30-хвилинної інкубації при 37 ° С діагностичні препарати багаторазово відмивають фізіологічним розчином і дистильованою водою.

Антитіла, мічені ФИТЦ, фіксуються тільки в місцях локалізації вірусних нуклеопротеїдних антигенів. Потім препарати висушують на повітрі і досліджують методом світлової мікроскопії, використовуючи як джерело світла ксенонової лампи і відповідний фільтр.

При непрямому варіанті антиген спочатку з’єднують з неокрашенной специфічної імунної сироваткою. Потім на утворилися нефлуоресцірующіх комплекси антиген-антитіло впливають міченої флуорохромом імунною сироваткою, що містить антитіла до білків специфічної сироватки. Непрямий варіант МФА поряд з виявленням антигену дозволяє кількісно визначати антитіла в досліджуваній сироватці шляхом відповідного її розведення.

Імуноферментний аналіз . Метод заснований на принципі сорбції білків на твердій фазі з наступним утворенням комплексів антиген-антитіло, що виявляються субстрат-індикаторним розчином. Додається в лунки антиген специфічно зв’язується з антитілами. На шар антигену наносять досліджувані сироватки в потрібних розведеннях. При наявності в них специфічних антитіл останні зв’язуються з антигеном. Для виявлення зв’язування на шар антитіл наносять імуноглобулін проти глобулінів сироватки людей, Кон’югований з пероксидазою хрону. Кількість сорбирующего коньюгата пропорційно кількості зв’язалися з антигеном антитіл сироваток людей. Це можна визначити, використовуючи індикаторний розчин (ортофенілілендіамін + перекис водню), компоненти якого в результаті дії пероксидази коньюгата забарвлюють рідина в коричнево-жовтий колір. При обстеженні неясних випадків застосування ІФА додатково до методів РП або РСК дозволяє збільшити достовірність лабораторної діагностики сказу, завдяки великій чутливості цього методу. Метод дозволяє виявляти інфекційні та дефектні частинки.

Для визначення антирабічних антитіл у процесі вакцинації можна застосовувати непрямий метод ІФА, використовуючи в якості антигену очищений вірус, а для визначення антитіл класу IgG в людській сироватці – А-білок стафілокока, пов’язаний з пероксидазою хрону. Результати ІФА порівняти з отриманими в тестах вірусної нейтралізації на мишах. Метод дозволяє виявляти присутність IgМ на початку процесу імунізації.

Імуноферментні методи – дуже перспективні для виявлення нуклеокапсідний антигену вірусу при посмертній діагностиці в тканинах головного мозку. У їх числі, наприклад, швидкий імуноферментний метод діагностики сказу, заснований на приготуванні плашок сенсибілізованих антитілами IgG изотипа до Нуклеокапсид першого серотипу, розведених в карбонатному буфері.

Матеріал для дослідження гомогенезируют в буфері або культуральному середовищі, освітлюють центрифугуванням, вносять в лунки і інкубують в плашках. Фіксований специфічними антитілами нуклеокапсідний антиген ідентифікують додаванням пероксидазного кон’югату з антінуклеокапсіднимі протіворабіческімі антитілами інший видоспецифічності і хромогенного субстрату. Чутливість методу складає 0,8-1,0 нг / мл.

Метод полімеразної ланцюгової реакції . Для експрес-діагностики вірусу сказу та ідентифікації лиссавирусов найбільш зручний метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Метод ПЛР – самий надійний і швидкий для виділення вирионной РНК з будь-яких проб, що містять вірус у низькій концентрації. З його допомогою можна створити багато копій РНК вірусу. Цей метод використовується для підтвердження результатів МФА і для визначення вірусу в слині, цибулинах волосся заднього відділу шиї і голови.

ПЛР заснована на принципі природної реплікації ДНК. Суть методу полягає в багаторазовому повторенні циклів синтезу (ампліфікації) вірусоспецифічні послідовності ДНК за допомогою термостабільної Taq ДНК-полімерази і двох специфічних затравок, так званих праймерів.

Кожен цикл складається з трьох стадій з різним температурним режимом. У кожному циклі подвоюється число копій синтезованого ділянки. Знову синтезовані фрагменти ДНК служать в якості матриці для синтезу нових ниток в наступному циклі ампліфікації, що дозволяє за 25-35 циклів напрацювати достатню кількість копій вибраної ділянки ДНК для її визначення, як правило, за допомогою електрофорезу в агарозному гелі.

Особливо висока чутливість ПЛР при використанні праймерів, комплементарних N-гену, коли вдається виявляти РНК вірусу в пробах, що містять вірус в титрі 10 МЛД50. Методом ПЛР можна виявляти РНК вірусу навіть в розклалася патологічному матеріалі.

В даний час розроблені і широко використовуються на практиці підтверджують (конфірматорние) тести, такі як ПЛР в обернено-транскріптазная виконанні (ОТ-ПЛР). Метод ОТ-ПЛР – високочутливий і найбільш ефективний. РНК екстрагується з тканин інфікованого вірусом органу, транскрибується в кДНК, яка потім амплифицируют методом ПЛР. Для постановки ОТ-ПЛР необхідні праймери, отримані до консервативних областям генома вірусу сказу. Зазвичай використовуються гени, що кодують нуклеопротеїн або N-білок.

Метод ПЛР високоспеціфічен і дуже чутливий. Є одним з найбільш точних тестів детекції рабічного антигену, дозволяє діагностувати сказ навіть за наявності в матеріалі хоча б одного віріона. В основі тесту лежить комплементарное добудовування РНК-матриці, здійснюване in vitro за допомогою ферменту РНК-полімерази. В останні роки ПЛР знаходить все більш широке застосування для діагностики та моніторингу вірусних інфекцій. Проте методика проведення складна, дорогостояща і поки недостатньо уніфікована для рутинного застосування.

Цитологічні методи в даний час мають обмежене діагностичне значення, але при ряді інфекцій і раніше повинні застосовуватися. Досліджуються матеріали аутопсії, біопсії, мазки, які після відповідної обробки фарбуються і аналізуються під мікроскопом. При сказі – це виявлення включень в цитоплазмі клітин (тільця Бабеша – Негрі).

Виділення вірусу . Виділення вірусу може бути необхідним для підтвердження результатів тестів з визначення антигену і для більш детальної характеристики ізолятів. І хоча цей метод є одним з найстаріших і трудомістких методів діагностики, сьогодні виділення вірусу з наступною ідентифікацією за допомогою одного з сучасних методів (ІФА з моноклональними антитілами або ПЛР) є найбільш достовірним методом діагностики, т. н. «Золотий стандарт».

Результативність методів діагностики сказу може варіювати залежно від ряду факторів (стадії хвороби, термінів забору матеріалу, якості отриманих проб, умов їх зберігання, досвідченості персоналу, якості реактивів та ін.) Якщо позитивний результат підтверджує сказ, то негативний не завжди свідчить про відсутність хвороби. Тому при сказі експерти ВООЗ рекомендують використовувати декілька тестів, особливо МФА в поєднанні з біопроб на новонароджених (2-3 денних) білих мишах.

Всі роботи з матеріалом, імовірно містить вірус сказу, так само як і з тваринами, підозрілими на сказ, повинні проводитися з дотриманням заходів особистої безпеки. Медичні працівники та ветеринарні лікарі повинні працювати в халатах, рукавичках, масках.

Пошук по сайту

Пропедевтика

Статті